Nariadenie vlády Slovenskej republiky o zavedení opatrení na tlmenie pseudomoru hydiny 314/2003 účinný od 15.05.2019

§ 1

(1)
Toto nariadenie ustanovuje opatrenia, ktoré sa použijú v prípade výskytu pseudomoru hydiny v chovoch hydiny a v chovoch poštových holubov a ostatných vtákov chovaných v zajatí. Týmto nariadením nie sú dotknuté ustanovenia osobitného predpisu.1)
(2)
Toto nariadenie sa nepoužije v prípade zistenia pseudomoru hydiny u iných druhov vtákov, ako sú vtáky uvedené v odseku 2; v takom prípade Štátna veterinárna a potravinová správa Slovenskej republiky (ďalej len „štátna veterinárna a potravinová správa“) oznámi Európskej komisii aké opatrenia prijíma.

§ 2

(1)
Na účely tohto nariadenia sa rozumie
a)
infikovanou hydinou všetka hydina,2) u ktorej
1.
bol podľa prílohy č. 4 vyšetrením vo schválenom laboratóriu3) úradne potvrdený pseudomor hydiny, alebo
2.
ak ide o druhé ohnisko alebo ďalšie ohniská, boli zistené klinické príznaky alebo postmortálne zmeny, ktoré nasvedčujú podozreniu na pseudomor hydiny,
b)
hydinou podozrivou z infekcie všetka hydina vykazujúca klinické príznaky alebo postmortálne zmeny, ktoré nasvedčujú podozreniu na prítomnosť pseudomoru hydiny,
c)
hydinou podozrivou z kontaminácie všetka hydina, ktorá mohla prísť priamo alebo nepriamo do kontaktu s vírusom pseudomoru hydiny,
d)
pomyjami kuchynské odpady, odpady z reštaurácií, prípadne z podnikov používajúcich mäso,
e)
príslušným úradom príslušný orgán veterinárnej správy,4)
f)
úradným veterinárnym lekárom veterinárny lekár ustanovený príslušným orgánom,5)
g)
poštovými holubmi holuby prepravované alebo určené na prepravu z holubníka na iné miesto na vypustenie na voľný let späť k holubníku alebo k nejakému inému miestu určenia,
h)
holubníkom každé zariadenie určené na ustajnenie alebo chov poštových holubov.
(2)
Na účely tohto nariadenia sa použijú aj pojmy uvedené v nariadení,6) ktorým sa transponujú právne záväzné akty Európskej únie uvedené v prílohe č. 1.

§ 5

(1)
Ak sa v chove úradne potvrdí výskyt pseudomoru hydiny, regionálna veterinárna a potravinová správa nariadi na doplnenie opatrení uvedených v § 4 ods. 2 vykonanie týchto opatrení:
a)
bezodkladne na mieste usmrtiť všetku hydinu v chove; uhynutá alebo usmrtená hydina a všetky vajcia musia byť zneškodnené tak, aby sa znížilo riziko šírenia nákazy na minimum,
b)
zneškodniť alebo vhodne ošetriť všetok materiál a všetky odpady, ktoré môžu byť kontaminované, ako sú krmivá, podstielka a hnoj, podľa inštrukcií úradného veterinárneho lekára tak, aby bola zaručená deštrukcia vírusu pseudomoru hydiny,
c)
vyhľadať a neškodne zničiť hydinové mäso pochádzajúce zo zvierat z príslušného chovu, ktoré bolo získané zabitím v období predpokladanej inkubačnej doby choroby,
d)
vyhľadať a neškodne zničiť násadové vajcia znesené v období predpokladanej inkubačnej doby a expedované z chovu, pričom hydina už vyliahnutá z týchto vajec musí byť úradne vyšetrená; vyhľadať a neškodne zničiť konzumné vajcia znesené v predpokladanej inkubačnej dobe a expedované z chovu s výnimkou tých, ktoré boli pred expedíciou dezinfikované podľa pokynov úradného veterinárneho lekára,
e)
po vykonaní činností uvedených v písmene a) a b) a v súlade s § 11 urobiť očistu a dezinfekciu budov využívaných na ustajnenie hydiny, ich okolia, dopravných prostriedkov a všetkého materiálu, ktorý môže byť kontaminovaný,
f)
po vykonaní činností uvedených v písmene
e)
ponechať budovy pre hydinu depopulované z nákazových dôvodov najmenej po dobu 21 dní pred ďalším zástavom hydiny,
g)
vykonať epizootologické vyšetrenie podľa § 7.
(2)
Regionálna veterinárna a potravinová správa môže rozšíriť opatrenia uvedené v odseku 1 na ďalšie susedné chovy v takom prípade, ak ich lokalizácia alebo kontakt s chovom, kde bola choroba potvrdená, dáva predpoklady na možnú kontamináciu pôvodcom ochorenia.
(3)
Ak bol v chove hydiny, v ktorom sa nevyskytli žiadne klinické príznaky pseudomoru hydiny, izolovaný vírus pseudomoru hydiny s indexom intracerebrálnej patogenity (ICPI) vyšším ako 0,7 a nižším ako 1,2 a v referenčnom laboratóriu Európskej únie uvedenom v § 15 bolo dokázané, že izolovaný vírus pochádza zo živej atenuovanej vakcíny proti pseudomoru hydiny, môže regionálna veterinárna a potravinová správa povoliť výnimku z ustanovení odseku 1 písm. a) až f) pod podmienkou, že v príslušnom chove bude nariadený úradný dozor na dobu 30 dní, počas ktorých sa vyžaduje najmä, aby
a)
boli uplatnené ustanovenia § 4 ods. 2 písm. a), b) a d) až f),
b)
žiadna hydina neopustila chov s výnimkou jatočnej hydiny odosielanej na bitúnok určený regionálnou veterinárnou a potravinovou správou,
c)
regionálna veterinárna a potravinová správa, ktorá zodpovedá za dozor nad určeným bitúnkom, bola vopred informovaná o úmysle presunu tej jatočnej hydiny na tento bitúnok, ktorá musí byť po presune umiestnená a zabitá oddelene od ostatnej hydiny.

§ 14

(1)
Štátna veterinárna a potravinová správa autorizuje14) národné referenčné laboratórium, ktoré
a)
má k dispozícii zariadenie a odborne spôsobilých zamestnancov, ktorí mu umožnia sústavne vykonávať typizáciu antigénnych a biologických vlastností vírusu pseudomoru hydiny a potvrdzovať výsledky získané štátnymi veterinárnymi laboratóriami,
b)
je zodpovedné za koordináciu diagnostických metód podľa tohto nariadenia a ich používania štátnymi veterinárnymi laboratóriami na území Slovenskej republiky.15)
(2)
Ústav kontroly veterinárnych liečiv kontroluje a schvaľuje vakcíny pred ich uvedením na trh.16)
(3)
Národné referenčné laboratórium je poverené koordináciou štandardov a diagnostických metód, používania reagencií a testovania vakcín a je poverené kontrolovať reagencie používané štátnymi veterinárnymi laboratóriami. Národné referenčné laboratórium Slovenskej republiky je uvedené v prílohe č. 5.
(4)
Na koordináciu štandardov a diagnostických metód určených pre štátne veterinárne laboratóriá15) na diagnostiku pseudomoru hydiny v členskom štáte Európskej únie a štáte, ktorý je zmluvnou stranou Dohody o Európskom hospodárskom priestore (ďalej len „členský štát“), národné referenčné laboratórium
a)
môže dodávať diagnostické reagencie štátnym veterinárnym laboratóriám,
b)
kontroluje kvalitu všetkých diagnostických reagencií používaných v štátnych veterinárnych laboratóriách,
c)
periodicky organizuje porovnávacie testy,
d)
uchováva izoláty vírusu pseudomoru hydiny pochádzajúce z potvrdených prípadov,
e)
potvrdzuje pozitívne výsledky získané v štátnych veterinárnych laboratóriách.
(5)
Národné referenčné laboratórium spolupracuje s národnými laboratóriami členských štátov a s referenčným laboratóriom Európskej únie.

§ 18

(1)
Ak sa u poštových holubov alebo iných vtákov držaných v zajatí vyskytne podozrenie z výskytu pseudomoru hydiny, regionálny veterinárny lekár neodkladne začne úradné vyšetrovanie na potvrdenie alebo vylúčenie nákazy, najmä vykoná alebo dá vykonať odber vzoriek na laboratórne vyšetrenie.
(2)
Od okamihu nahlásenia podozrenia uvedeného v odseku 1 regionálna veterinárna a potravinová správa nariadi úradné pozorovanie holubníka alebo chovu a nariadi, aby žiadny holub alebo vták držaný v zajatí alebo všetko, čo môže prenášať nákazu, nemohlo opustiť holubník alebo chov.
(3)
Opatrenia uvedené v odsekoch 1 a 2 nesmú byť zrušené až dovtedy, kým regionálny veterinárny lekár nevylúči podozrenie zo pseudomoru hydiny.
(4)
Ak je infekcia úradne potvrdená, regionálna veterinárna a potravinová správa nariadi
a)
opatrenia podľa § 5 ods. 1 písm. a), b), e) a f) pre poštové holuby alebo vtáky držané v zajatí a pre holubníky alebo chovy infikované pseudomorom hydiny, alebo
b)
minimálne
1.
zákaz pohybu holubov alebo vtákov držaných v zajatí mimo holubníka alebo chovu najmenej 60 dní po vymiznutí klinických príznakov pseudomoru hydiny,
2.
neškodné zničenie alebo ošetrenie všetkého materiálu a odpadu, ktorý môže byť kontaminovaný, ošetrenie musí zaručiť deštrukciu všetkých vírusov pseudomoru hydiny a odpadov nahromadených počas 60 dní podľa bodu 1,
c)
epizootologické vyšetrenie podľa § 7.
(5)
Informácie týkajúce sa nákazy a informácie o uplatnených opatreniach sa zasielajú hlásením podľa osobitného predpisu.17)

§ 20

(1)
Pohotovostný plán špecifikujúci opatrenia, ktoré sa budú realizovať pri vzniku ohniska pseudomoru hydiny, sa vypracuje podľa osobitného predpisu.18) Vypracovaný pohotovostný plán sa podľa potreby aktualizuje.
(2)
Pohotovostný plán musí umožniť prístup k budovám, zariadeniam, personálu a všetkému ďalšiemu príslušnému materiálu nevyhnutnému na rýchlu a účinnú eradikáciu ohniska pseudomoru hydiny a musí jednoznačne určiť požiadavky na vakcíny pre prípad núdzovej vakcinácie.
(3)
Pohotovostný plán a aktualizácia pohotovostného plánu sa predkladá hlásením podľa osobitného predpisu.19)

§ 21

V rozsahu potrebnom na jednotné použitie právne záväzných aktov Európskej únie uvedených v prílohe č. 1 môžu experti Európskej komisie vykonávať v spolupráci s príslušnými úradmi4) kontroly na mieste v Slovenskej republike. Pri týchto kontrolách môžu kontrolovať reprezentatívny počet prevádzkarní, aby sa presvedčili, či príslušné úrady kontrolujú, ako prevádzkarne spĺňajú požiadavky tohto nariadenia. Príslušné úrady,4) iné orgány verejnej správy a osoby, ktorých sa tieto kontroly týkajú, poskytnú týmto expertom Európskej komisie pri plnení ich úloh všetku potrebnú pomoc a najmä im umožnia prístup ku všetkým potrebným informáciám, dokladom a osobám, ako aj vstup do miest, prevádzkarní, zariadení a dopravných prostriedkov na účely vykonávania kontrol v rovnakom rozsahu ako príslušnému úradu.

Príloha č. 1 k nariadeniu vlády č. 314/2003 Z. z.


ZOZNAM PREBERANÝCH PRÁVNE ZÁVÄZNÝCH AKTOV EURÓPSKEJ ÚNIE


1.
Smernica Rady 92/66/EHS zo 14. júla 1992 zavádzajúca opatrenia Spoločenstva na kontrolu pseudomoru hydiny (Mimoriadne vydanie Ú. v. EÚ, kap. 3/zv. 13) v znení

2.
Smernica Rady 2008/73/ES z 15. júla 2008, ktorou sa zjednodušujú postupy zostavovania zoznamov a uverejňovania informácií vo veterinárnej a zootechnickej oblasti a ktorou sa menia a dopĺňajú smernice 64/432/EHS, 77/504/EHS, 88/407/EHS, 88/661/EHS, 89/361/EHS, 89/556/EHS, 90/426/EHS, 90/427/EHS, 90/428/EHS, 90/429/EHS, 90/539/EHS, 91/68/EHS, 91/496/EHS, 92/35/EHS, 92/65/EHS, 92/66/EHS, 92/119/EHS, 94/28/ES, 2000/75/ES, rozhodnutie 2000/258/ES a smernice 2001/89/ES, 2002/60/ES a 2005/94/ES (Ú. v. EÚ L 219, 14. 8. 2008).

3.
Smernica Európskeho parlamentu a Rady (EÚ) 2018/597 z 18. apríla 2018, ktorou sa mení smernica Rady 92/66/EHS zavádzajúca opatrenia Spoločenstva na kontrolu pseudomoru hydiny (Ú. v. EÚ L 103, 23. 4. 2018).

Príloha č. 2 k nariadeniu vlády č. 314/2003 Z. z.


SCHVAĽOVANIE PRESUNOV VAJEC Z CHOVU
Povolenie vydané regionálnou veterinárnou a potravinovou správou na presun vajec z podozrivého chovu, podliehajúceho ustanoveniam § 4 ods. 2 písm. e), do zariadenia schváleného na spracovanie a ošetrenie vaječných produktov v súlade s osobitným predpisom20) (ďalej len „určené zariadenie“) musí spĺňať tieto podmienky:


1.
Vajcia odsunuté z chovu podozrivého z nakazenia musia

a)
vyhovovať požiadavkám ustanoveným v osobitnom predpise,21)

b)
byť odoslané priamo z chovu podozrivého z nakazenia do určeného zariadenia; každá zásielka musí byť pred odoslaním zapečatená úradným veterinárnym lekárom chovu podozrivého z nakazenia a musí zostať zapečatená po celý čas transportu až do určeného zariadenia.

2.
Úradný veterinárny lekár chovu podozrivého z nakazenia informuje príslušnú regionálnu veterinárnu a potravinovú správu určeného zariadenia o svojom úmysle zaslať do tohto určeného zariadenia vajcia.

3.
Príslušná regionálna veterinárna a potravinová správa, do ktorej pôsobnosti určené zariadenie patrí, nariadi, aby

a)
vajcia uvedené v odseku 1 písm. b) boli držané izolovane od ostatných vajec od ich príchodu až do ošetrenia,

b)
škrupiny týchto vajec boli považované za vysokorizikový materiál a bolo s nimi nakladané v súlade s požiadavkami kapitoly II citovanej smernice,

c)
obalový materiál, použité dopravné prostriedky na prepravu vajec uvedené v odseku 1 písm. b) a všetky miesta, s ktorými vajcia prišli do styku, boli vyčistené a dezinfikované takým spôsobom, aby bol vírus klasického moru hydiny zničený,

d)
úradný veterinárny lekár chovu podozrivého z nakazenia bol informovaný o všetkých zásielkach ošetrených vajec.

Príloha č. 4 k nariadeniu vlády č. 314/2003 Z. z.


DIAGNOSTICKÉ METÓDY NA POTVRDENIE A DIFERENCIÁLNU DIAGNOSTIKU PSEUDOMORU HYDINY


Metódy izolácie a charakterizovanie vírusov klasického moru hydiny uvedené ďalej musia byť považované za orientačné a za minimá, ktoré treba použiť na diagnostiku nákazy.

Vírus, ktorý vyvoláva pseudomor hydiny, je prototypový vírus Paramyxoviridae. V súčasnosti je známych deväť skupín aviárnych paramyxovírusov, ktoré môžu byť sérologicky rozlíšené a ktoré sú označené PMV–1, PMV–2 až PMV–9. Všetky vírusy pseudomoru hydiny sú zaradené do skupiny PMV–1. Pre diagnostické metódy na potvrdenie pseudomoru hydiny a na diferenciálnu diagnostiku možno použiť túto definíciu:

Pseudomor hydiny je infekcia vyvolaná všetkými aviárnymi kmeňmi paramyxovírusu 1, ktoré majú u jednodňových kurčiat index intracerebrálnej patogenity (ICPI) vyšší než 0,7.

Odber a ošetrenie vzoriek
1.
Odber vzoriek


Výtery z kloaky (alebo výkaly) a tracheálne výtery od chorých vtákov; výkaly alebo obsahy čriev, zreteľne postihnuté orgány (mozog, trachea, pľúca, pečienka, slezina a iné) z čerstvých hydinových kadáverov.
2.
Ošetrenie vzoriek


Orgány a tkáne uvedené v odseku 1 môžu byť združované, ale je nutné, aby výkaly boli vyšetrené oddelene. Výtery musia byť umiestnené do dostatočného množstva roztoku s antibiotikami, aby sa zaistilo ich úplné ponorenie. Vzorky výkalov a orgánov musia byť homogenizované (pomocou uzatvoreného homogenizátora alebo paličky a trecej misky so sterilným pieskom) v médiu s antibiotikami tak, aby sa získala 10 % – 20 % suspenzia (hmotnosť/objem) v médiu. Suspenzia sa nechá stáť približne 2 hodiny pri teplote miestnosti (alebo dlhšiu dobu pri 4 oC), potom sa centrifuguje (napríklad 800 g –1 000 g po dobu 10 minút).
3.
Médium s antibiotikami


Rôzne laboratóriá používali s úspechom rôzne zloženia médií s antibiotikami; národné laboratóriá môžu poskytnúť potrebné odporúčania príslušnej krajine. Pre vzorky výkalov sú nutné vyššie koncentrácie antibiotík. Typické je nasledujúce zloženie: 10 000 jednotiek/ml penicilínu, 10 mg/ml streptomycínu, 0,25 mg/ml gentamycínu a 5 000 jednotiek/ml mycostatínu vo fosfátovom pufrovanom roztoku (STP). Pre tkanivá a tracheálne výtery môžu byť tieto množstvá päťkrát nižšie. Na potlačenie chlamydií je povolený prídavok 50 mg/ml oxytetracyklínu. Na prípravu média je nutné, aby bolo po pridaní antibiotík skontrolované pH a upravené medzi 7,0 a 7,4.

Izolácia vírusu

Izolácia vírusu z embryí slepačích vajec

Do alantoidnej dutiny najmenej 4 embryí slepačích vajec inkubovaných 8 až 10 dní sa inokuluje 0,1 až 0,2 ml číreho supernatantu. Ideálne by tieto vajcia mali pochádzať z kŕdľa bez špecifických patogénov (SPF); ak to nie je možné, pripúšťa sa používať vajcia pochádzajúce z kŕdľa, v ktorom nebol zistený výskyt protilátok proti vírusu pseudomoru hydiny. Inokulované vajcia sú inkubované pri 37 oC a sú denne presvecované. Postupne musia byť vajcia s uhynutými alebo hynúcimi embryami a všetky ostatné vajcia po 6 dňoch inokulácie schladené na 4 oC a ich alantoidná/amniová tekutina sa vyšetruje na hemaglutiníny. Ak nedôjde k hemaglutinácii, uvedený postup sa opakuje, pričom sa ako inokulum používa neriedená alantoidná/amniová tekutina.

V prípade hemaglutinácie musí byť kultiváciou vylúčená prítomnosť baktérií. Pokiaľ sú baktérie prítomné, môže sa tekutina filtrovať cez membránový ultrafilter 450 nm s dodatočným pridaním antibiotík; inokulácia kuracích embryí sa vykonáva podľa uvedeného opisu.

Diferenciálna diagnostika
1.
Predbežná diferenciácia


Všetky hemaglutinačné vírusy musia byť odoslané do národného referenčného laboratória na úplnú identifikáciu, charakterizáciu a na testy patogenity. Vzhľadom na to, že je dôležité realizovať čo najskôr protinákazové opatrenia proti pseudomoru hydiny s cieľom obmedziť šírenie vírusu, každé štátne veterinárne laboratórium by malo byť schopné identifikovať vírus pseudomoru hydiny. Hemaglutinačné tekutiny budú použité v hemaglutinačnom teste, ktorý je opísaný v ďalšom texte. Pozitívna inhibícia, t. j. 24 alebo vyššia, pomocou polyklonálnych antisér špecifických pre vírus pseudomoru hydiny s titrom minimálne 29 môže slúžiť na predbežnú identifikáciu umožňujúcu začatie dočasných opatrení tlmenia.
2.
Potvrdenie


Národné referenčné laboratórium by malo urobiť úplnú diferenciálnu diagnostiku všetkých hemaglutinačných agensov. Potvrdenie vírusu pseudomoru hydiny sa musí znovu vykonať pomocou testov inhibície hemaglutinácie s monošpecifickým kuracím sérom. Testy na stanovenie indexu intracerebrálnej patogenity podľa postupu opísaného v ďalšom texte by mali byť urobené so všetkými pozitívnymi izolátmi. Indexy patogenity vyššie než 0,7 poukazujú na prítomnosť vírusu a vyžadujú použitie kompletných opatrení tlmenia.

Na základe nových poznatkov v typizácii vírusu pseudomoru hydiny, najmä metód používajúcich monoklonálne protilátky, možno zaradiť kmene a izoláty do skupín. Existujú monoklonálne protilátky špecifické pre vakcinačné kmene, ktoré môžu byť použité v jednoduchých testoch inhibície hemaglutinácie.

Vzhľadom na to, že často môžu byť z hydinových vzoriek izolované kmene živých vakcín vyplývajú zjavné výhody, ktoré predstavuje ich rýchla identifikácia. Tieto monoklonálne protilátky môžu byť získané v referenčnom laboratóriu Európskej únie a môžu byť dodané do národných laboratóríí.

Národné laboratóriá by mali poskytnúť všetky hemaglutinačné agensy referenčnému laboratóriu Európskej únie.
3.
Ďalšia typizácia a charakteristika izolátov


Referenčné laboratórium Európskej únie musí získať od národného referenčného laboratória každý hemaglutinačný vírus na doplnenie antigénnych a genetických štúdií umožňujúcich lepšie pochopiť epizootológiu choroby (alebo chorôb) vnútri Európskej únie v rámci kompetencií a úloh referenčného laboratória Európskej únie.

Rýchle testy na detekciu vírusu a protilátok proti pseudomoru hydiny

Rýchle testy detekcie vírusu pseudomoru hydiny u vakcinovaných vtákov a určenie protilátok u nevakcinovaných vtákov
1.
Detekcia vírusu pseudomoru hydiny


Pri diagnostike infekcií u vakcinovaných vtákov boli použité rôzne rýchle testy umožňujúce priamo detekovať antigény pseudomoru hydiny. Najbežnejšie sú používané testy s fluorescenčnými protilátkami na pozdĺžnych rezoch priedušnice a testy s protilátkami s naviazanou peroxidázou na rezoch z mozgu. Na infekcie vyvolané vírusom pseudomoru hydiny môžu byť použité aj iné priame testy na detekciu antigénu. Nevýhodou týchto testov je, že vyšetrenie všetkých potenciálnych miest replikácie vírusu pseudomoru hydiny u vakcinovaných vtákov nie je vykonateľné. Napríklad neprítomnosť dôkazu vírusu v priedušnici nevylučuje replikáciu vírusu v čreve.
2.
Detekcia protilátok u nevakcinovaných vtákov


Vo väčšine laboratórií sa na diagnostiku pseudomoru hydiny využíva hemaglutinačne inhibičný test, ktorým sa určujú titre protilátok. V ďalšom texte je tento test opísaný. Možno používať aj imunoenzymtické metódy (ELISA), ale vhodné je výsledky týchto testov kontrolovať v národnom referenčnom laboratóriu.
a)
Vzorky – V kŕdľoch, ktoré majú menej ako 20 jedincov, sa odoberajú krvné vzorky od všetkých kusov a od 20 jedincov vo väčších kŕdľoch (dáva 99 % pravdepodobnosť na odhalenie najmenej jedného pozitívneho séra, ak je 25 % zvierat alebo viac pozitívnych). Krv sa nechá zraziť a oddelí sa sérum.

b)
Vyšetrenie na protilátky – Individuálne vzorky krvných sér musia byť vyšetrené štandardným hemaglutinačne inhibičným testom opísaným v ďalšom texte. Rozdielne sú názory na vhodnosť použitia štyroch alebo ôsmich hemaglutinačných jednotiek. Použitý antigén ovplyvní hladinu, pri ktorej je sérum považované za pozitívne. Pre 4 hemaglutinačné jednotky sa za pozitívne považujú séra, pri ktorých sa titer rovná alebo je vyšší ako 24, pre 8 hemaglutinačných jednotiek sú pozitívne séra od 23.


Hemaglutinačný test (Ha)

Reagencie
1.
Izotonický pufrovaný fosfátový roztok (STP) (0,05M) pH medzi 7,0 a 7,4.

2.
Odoberie sa zmes červených krviniek pochádzajúcich najmenej od 3 sliepok bez špecifikovaných patogénov (ak nie sú k dispozícii, odoberie sa krv od hydiny pravidelne kontrolovanej a uznanej bez výskytu protilátok proti vírusu pseudomoru hydiny); krvinky sa dajú do rovnakého objemu Alseverovho roztoku. Pred použitím sa krvinky 3 krát premyjú v STP. Pre ďalší test sa odporúča 1 % suspenzia (hematokritová hodnota) v STP.

3.
Ako štandardný antigén sa odporúča kmeň Ulster 2C vírusu pseudomoru hydiny.


Metóda
1.
Do každej jamky doštičky pre mikrometódu z plastu (s dnom v tvare V) sa aplikuje 0,025 ml STP.

2.
Do prvej jamky sa aplikuje 0,025 ml vírusovej suspenzie (t. j. alantoidnej tekutiny).

3.
Použije sa mikrozrieďovač alebo sa pripraví dvojnásobné sériové riedenie vírusu z jamky do jamky (1 : 2 až 1 : 4 096).

4.
Do každej jamky sa pridá 0,025 ml STP.

5.
Do každej jamky sa pridá 0,025 ml 1 % krviniek.

6.
Premieša sa ľahkými poklepmi a nechá sa stáť pri 4 oC.

7.
Doštičky sa posudzujú o 30 až 40 minút, ihneď, ako je dokončená kontrolná sedimentácia. Na posúdenie sa doštička nakloní, aby bolo možné pozorovať prítomnosť alebo neprítomnosť „toku“ krviniek vo forme slzy. V jamkách bez hemaglutinácie by mali krvinky prúdiť v rovnakom rytme ako v kontrolných jamkách bez vírusu.

8.
Hemaglutinačný titer zodpovedá najvyššiemu zriedeniu, ktoré vyvoláva aglutináciu krviniek. Toto zriedenie môže byť považované za zriedenie obsahujúce jednu hemaglutinačnú jednotku. Presnejšia metóda na určenie hemaglutinačného titru spočíva vo vykonaní testov HA s vírusom pochádzajúcim z úplnej stupnice počiatočného riedenia typu 1 : 3, 1 : 4, 1 : 5, 1 : 6 atď. Táto metóda sa odporúča na presnú prípravu antigénu určeného na test inhibície hemaglutinácie.


Test inhibície hemaglutinácie (HI)

Reagencie
1.
Pufrovaný fosfátový roztok (STP).

2.
Alantoidná tekutina obsahujúca vírus, zriedená v STP a obsahujúca 4 alebo 8 hemaglutinačných jednotiek v 0,025 ml.

3.
Kuracie 1 % červené krvinky.

4.
Kontrolné negatívne kuracie sérum.

5.
Kontrolné pozitívne sérum.


Metóda
1.
Do každej jamky plastovej doštičky pre mikrometódu (jamky s dnom v tvare V) sa aplikuje 0,025 ml STP.

2.
Do prvej jamky doštičky sa aplikuje 0,025 ml séra.

3.
Na prípravu dvojnásobných zriedení séra z jamky do jamky sa používa mikrozrieďovač.

4.
Pridá sa 0,025 ml neriedenej alantoidnej tekutiny obsahujúcej 4 alebo 8 hemaglutinačných jednotiek.

5.
Premieša sa ľahkými poklepmi a doštička sa nechá minimálne 60 minút stáť pri 4 oC alebo minimálne 30 minút pri teplote miestnosti.

6.
Do každej jamky sa pridá 0,025 ml 1 % krviniek.

7.
Premieša sa ľahkými poklepmi a nechá sa stáť pri 4 oC.

8.
Doštičky sa posudzujú o 30 – 40 minút, ihneď, ako je ukončená sedimentácia kontrolných krviniek. Posudzuje sa naklonením doštičky, aby bolo možné pozorovať prítomnosť alebo neprítomnosť „toku“ vo forme slzy, ktorý sa pohybuje v rovnakom rytme ako v kontrolných jamkách obsahujúcich len krvinky (0,025 ml) a PBS (0,05 ml).

9.
HI titer zodpovedá najvyššiemu zriedeniu antiséra, ktoré spôsobí úplnú inhibíciu 4 alebo 8 jednotiek vírusu (do každého HI testu musí byť zaradená titrácia HA na účely potvrdenia prítomnosti požadovaného počtu hemaglutinačných jednotiek).

10.
Platnosť výsledkov závisí od získania titru nižšieho než 23 pre 4 hemaglutinačné jednotky alebo 22 pre 8 hemaglutinačných jednotiek s kontrolným negatívnym sérom a získanie titru o jedno zriedenie bezprostredne vyššie alebo bezprostredne nižšie v pomere k známemu titru kontrolného pozitívneho séra.


Index intracerebrálnej patogenity (IPIC)
1.
V sterilnom fyziologickom roztoku sa zriedi 1 : 10 infekčná, čerstvo získaná alantoidná tekutina (HA titer musí byť vyšší ako 24 – použitie antibiotík je zakázané).

2.
Intracerebrálne sa injikuje po 0,05 ml zriedeného vírusu 10 jednodňovým kurčatám (t. j. starým viac ako 24 hodín a menej ako 40 hodín po vykľuvaní); tieto kurčatá musia pochádzať z vajec kŕdľa SPF.

3.
Kurčatá sa 8 dní vyšetrujú v intervale každých 24 hodín.

4.
Pri každom pozorovaní sa každému jedincovi pridelí koeficient: 0 = normálny, 1 = chorý, 2 = uhynutý.

5.

Klinické príznaky Dni po aplikácii Celkové skóre 1 2 3 4 5 6 7 8 Normálne 10 4 0 0 0 0 0 0 14 x 0 = 0 Choré 0 6 10 4 0 0 0 0 20 x 1 = 20 Uhynuté 0 0 0 6 10 10 10 10 46 x 2 = 92 Spolu = 114 Index = priemerný výsledok pre zviera a pre pozorovanie = 112/80 = 1,4

Hodnotenie kapacity tvorby plakov
1.
Všeobecne sa dáva prednosť použitiu takej stupnice riedenia vírusu, aby sa získal optimálny počet plakov na doštičke. Malo by postačovať desaťnásobné riedenie v STP dosahujúce až 10-7.

2.
V Petriho miskách s priemerom 5 cm sa pripravia súvislé monovrstvy embryonálnych kuracích buniek alebo vhodných líniových buniek (napr. Madin-Darby bovinná oblička).

3.
Do každej z dvoch Petriho misiek sa pridá 0,2 ml každého zriedeného vírusu a vírus sa nechá absorbovať v pokoji 30 minút.

4.
Po trojnásobnom premytí v STP sú infikované bunky znovu prekryté vhodným médiom obsahujúcim 1 % agaru (hmotnosť/objem) a prípadne 0,01 mg/ml trypsínu. Je dôležité nepridávať do prekrývajúceho média žiadne sérum.

5.
Po 72-hodinovej inkubácii pri 37 oC by mali plaky dosiahnuť dostatočnú veľkosť. Na účely ľahšieho pozorovania sa odstráni agarová pokrývka a jednovrstevná kultúra sa zafarbí kryštalvioleťou (0,5 % hmotnosť/objem) v 25 % (objem/objem) etanolu.

6.
Ak sú inkubované v médiu, ktoré obsahuje trypsín, musia všetky vírusy vytvárať jasné plaky. Ak prekrývajúce médium neobsahuje trypsín, tvoria plaky len vírusy, ktoré sú virulentné pre kurčatá.